一.小耳畸形的遗传学研究进展

　　The genetics research progress of microti

　　章庆国，程琳

　　小耳畸形是一种外耳和中耳发育异常的先天性畸 形，是我国第二大颅面部先天性疾病，发病率为5.18/万[1]。 其一般是指耳廓畸形，部分同时合并外耳道、鼓膜、 中耳听小骨畸形，90% 以上的小耳畸形患者合并患 侧传导性听力损失。除了耳部畸形，约 60% 的小耳 畸形可伴随其他部位畸形，如下颌骨、颞骨发育不良， 面神经发育不良、大口畸形及心脏、肾脏、脊柱先天 性畸形 [2 ～ 4]。由于临床工作中小耳畸形合并第一二 鳃弓来源结构的畸形较为多见，目前普遍把小耳畸形 认为是第一二鳃弓综合征的一部分。小耳畸形也可以 是其他综合征的一部分，如鳃耳综合征(BO)、鳃 耳肾综合征(BOR)、Goldenhar 综合征、Treacher Collins 综合征。 小耳畸形遗传学发病机制一直以来都是研究的核 心内容。目前的研究结果多数来源于动物模型以及人 类小耳畸形相关综合征的研究。前期动物模型研究已 经取得了较大进展，尤其是近期 Minoux 关于 Hoxa2 基因与小鼠耳畸形的深入研究，更新了目前对耳胚胎 发育及小耳的发育形成过程的认识 [5]。关于人类的小 耳畸形，研究者们通过传统的连锁分析的方式定位 了部分家系中综合征型的小耳畸形的致病基因。随 着全基因组关联研究及外显子测序技术的应用，小 耳畸形相关综合征以及单纯性小耳畸形的遗传学病 因研究也获得了较大进展 [6]。 1 外耳的胚胎发育 经典的外耳发育模式是 His 小丘模式。1882 年 His 研究发现胚胎 6 周时可见第一鳃弓下颌突和第二 鳃弓各有 3 个小丘。随着第一、二鳃弓及其之间的 鳃裂发育，小丘逐渐融合，分化形成外耳特定结构： 小丘 1 发育成耳屏，小丘 2、3 形成耳轮和耳轮脚， 小丘 4、5 发育为对耳轮，小丘 6 形成耳垂。至第 8 ～ 9 周，外耳基本轮廓形成 [7，8]。随后各学者对小丘理论 进一步完善。Streeter 等经过研究发现各个小丘发育 顺序上存在一定差异，小丘 4、5 首先出现，其次为 小丘 1，接着出现小丘 6，最后是小丘 2、3。耳廓的 大部分结构来源于第二鳃弓，耳屏、耳轮脚及部分 耳轮来源于第一鳃弓 [9]。Porter 和 Tan[10] 在 Streeter [关键词] 小耳畸形(Microtia);遗传学(Genetic Contribution);胚胎发育(Embryology) 章庆国 中国医学科学院整形四科(外耳再造二中心)，北京 100144 浙江人，主任医师，教授，博士研究生导师，主要从事耳廓畸形和缺损 的临床研究及先天性小耳畸形的病因学研究等工作。 Email：plastic135@126.com 程琳 北京积水潭医院烧伤整形外科，北京 100035 [摘 要] 小耳畸形是一种外耳和中耳发育异常的先天性畸形，其发生原因包括环境因素和遗传因素。小耳畸形的遗传学因 素是病因研究的核心。目前在综合征型小耳畸形遗传病因方面已经取得了一定研究成果。近年来随着研究技术如高通量测 序技术的进步，非综合征型小耳畸形的胚胎学和病因学研究也获得了很大进展。

　　[Abstract] Microtia encompasses a spectrum of congenital anomalies of the external and middle ear. The pathogenesis of microtiais perplexing，including environmental contribution and genetic factors. Research on genetic mutation site is of great importance to illuminate pathogenesis of microtia. Great progress has been achieved in genetics of syndromic microtia. Recently，with the developmentof next generation sequencing，the research of nonsyndromic microtia has made great achievements in embryology and genetics.

　　万方数据专题论坛 耳廓美学 FEATURE 25 中国医学文摘耳鼻咽喉科学 Chinese Medical Digest：Otorhinolaryngology/ Jan. 2017, Vol.32, No.1 研究的基础上，总结提出了另外一种外耳发育模式。 胚胎发育第 5 周，第一鳃弓下颌突和第二鳃弓开始 出现，第 6 周小丘开始出现，随后小丘很快消失， 在第二鳃弓头侧出现一个游离耳皱褶(free ear fold) [11]。至发育第 9 周，第一、第二鳃弓逐渐融合，第一 鳃裂消失。第一鳃弓形成耳屏、部分耳轮以及锤骨头、 砧骨体 [7]，第二鳃弓形成外耳大部分 [12]。有学者认 为外耳道是由胚胎发育期间第一鳃裂向内逐渐凹陷、 第一鳃裂外胚层上皮紧随向内逐渐延伸，与从内向外 扩展的内胚层来源中耳腔相遇形成 [8，13]。 Minoux 等 [14，15] 通过研究 Hoxa2 基因来研究外 耳的胚胎发育。Hoxa2 基因是第二鳃弓内唯一表达的 Hox 基因，调节神经嵴细胞(NCC)的前后轴模式， 在耳发育过程中发挥至关重要的作用。研究表明某一 体节 Hox 基因的缺失，可以导致其支配区域的组织 分化成为其前一体节的相应结构 [7]。Minoux 等 [5，15] 在小鼠的研究中发现，Hoxa2 基因失活小鼠除了表现 为无耳畸形，还出现了外耳道、锤骨及砧骨的重复。 而外耳道、锤骨及砧骨均来源于第一鳃弓 [14]。进一 步对外耳道周围的组织进行追踪结合研究原基分布 图，结果显示外耳道完全来自于第一鳃弓，是由第一 鳃弓的组织局部内陷形成 [5]。因此，目前认为除外耳 道，耳屏和耳轮脚来自于第一鳃弓。这个观点也得 到了临床方面的证实：① HOXA2 基因突变的患者表 现为小耳畸形，但不累及耳屏 [16，17];Alasti 报道在 一个常染色体隐性遗传的综合征型小耳畸形家系中 发现了 HOXA2 的错义突变 [16]，受累个体表现双侧 II 度小耳畸形，耳屏存在，外耳道狭窄;Brown 等 [17] 在一个常染色体显性遗传的非综合征型小耳畸形家 系中发现了 HOXA2 的无义突变，家系内受累个体表 现为双侧 I 度或 II 度小耳畸形，外耳道正常，耳屏存 在。其中 Alasti 的家系与小鼠 Hoxa2 基因失活的表 型类似 [16]。 通过对第二腮弓的胚胎发育进行追踪，发现外耳 的大部分结构来源于第二鳃弓。第一鳃弓来源的组织 包括部分耳轮脚、耳屏、外耳道 [18]。下一步研究可 以通过寻找合适的方法对第一鳃弓的组织进行追踪， 获得更为直观的结果。 另外，前期研究已经证实了附耳和小耳畸形的相 关性，近期关于附耳发育的研究从胚胎学水平揭示了 小耳畸形与附耳的关系。通常认为附耳是第一鳃裂边 缘第一鳃弓内组织过度发育形成。随着第一二鳃弓发 育形成上颌骨、下颌骨及面部组织，位于第一二鳃弓 融合部位的附耳逐渐迁移，定位于耳前与口角之间 的区域。面部皮赘及多耳(或镜像耳)是附耳的一 种特殊形式 [19]。对于合并附耳的患者，更需要进行 详细体格检查如外耳、内耳及身体其他系统的畸形， 来鉴别是否合并综合征，如附耳畸形常见于 BOR 综 合征和 BO 综合征，不常见于 CHARGE 综合征和 TreacherCollins 综合征 [14，19]。 Minoux 等研究结果显示，Hoxa2 异位表达的小 鼠不仅表现为镜像外耳道，还经常合并出现附耳，附 耳组织表达 Bmp4，Bmp5 及 Twsg1 等基因。这些基 因调控软骨细胞的增殖和发育，是 Hoxa2 基因的下 游基因，可以在第二鳃弓内表达。基因表达被干扰后， 表现为小耳畸形 [20，21]。因此推断，附耳及皮赘等都 是胚胎发育期间未完全发育的外耳组织，临床观察可 发现附耳通常包含部分软骨组织，进一步证实了附耳 来源于 HOXA2 异位表达的推论 [22]。 Minoux 的研究将小耳畸形的表型特征与遗传病 因相联系，对于揭示小耳畸形的发病因素意义重大， 下一步可以通过总结小耳畸形的表型特征预测可能 累及的基因，根据相应的特点进行遗传学验证。 2 遗传学研究进展 2.1 染色体水平变异。先天性小耳畸形患者存在一 定比例的染色体变异 [23，24]，小耳畸形在 18 号染色体 三倍嵌合体中的发生率为 25%[25];22 号染色体三体 患者合并耳畸形比较常见，表现为双侧外耳位置较低 或者小耳畸形 [24];13 号染色体三倍体嵌合体合并小 耳畸形者也有报道。此外，也有染色体结构变异的报 道包括 4p、5p、22q、18q 染色体末端的缺失及 6p24 的易位 [26 ～ 28]。 2.2 基因水平变异。前期动物模型的研究已经取得 了很大进展。家系连锁分析、致病基因定位等传统 基因研究方法在小耳畸形相关综合征如 Goldenhar 综 合征、Treacher-Collins 综合征及 Nager 综合征致病基 因定位时起到了重要的作用，病因分析可以深入至分 子水平 [29]。小耳畸形相关的 18 余种综合征中已发现 基因异常(表 1)。对综合征型小耳畸形致病因素进 行分析可以发现，尽管各综合征之间临床表现相互覆 盖，其致病基因却未发现明显的重复，这给小耳致病 万方数据FEATURE 专题论坛 耳廓美学 26 中国医学文摘耳鼻咽喉科学 Chinese Medical Digest：Otorhinolaryngology/ Jan. 2017, Vol.32, No.1 基因的确定带来了较大的困难 [30]。对常见的综合征 型小耳畸形病因进行总结，认为小耳畸形病因可以 分为以下两类 [30]：①导致鳃弓发育畸形的基因及相 关调控基因，如 HOX 基因、SIX 基因，TCOF1 基因 [31];②相应信号通路的异常，如成纤维细胞生长因子 信号通路 [32]。 表 1 小耳畸形合并症的致病基因 小耳畸形相关综合征 导致畸形的基因 耳 - 髁综合征 PLCB4，GNAI3 鳃耳面综合征 TFAP2A 鳃耳肾综合征 / 鳃耳综合征 EYA1，SIX1，SIX5 CHARGE 综合征 CHD7，(SEMA3E) Klippele-Feil 综合征 GDF6 LAMM 综合征 FGF3 LADD 综合征 FGFR2，FGFR3，FGF10 MeiereGorlin 综合征 ORC1，ORC4，ORC6，CDT1， CDC 小耳 - 听力障碍、腭裂综合征 HOXA2 Miller 综合征 DHODH 眼耳综合征 HMX1 Nager 综合征 SF3B4 Townes-Brocks 综合征 SALL1 Treacher-Collins 综合征 TCOF1，POL1RC，POL1RD Miller 综合征 DHODH Fraser 综合征 FRAS1，FREM2，GRIP1 2.2.1 与鳃弓发育相关的基因。 2.2.1.1 Hox 基因。是一类在进化过程中高度保守的 DNA 序列，是一种同源异型盒基因，其表达遵循时 空模式，即按照发育的进程，Hox 基因先后表达，在 机体的不同部位 Hox 基因差异表达 [33]。Hox 基因通 过调节胚胎时期第二鳃弓 NCCs 的前后体轴发挥重要 作用。一旦 Hox 基因表达异常或者缺失，则可能会 造成表型的异常 [34]。Hoxa1 失活的小鼠表现为外、中、 内耳畸形;Hoxa1 和 Hoxb1 的复合突变体表现为无 耳畸形;Hoxb6 和 Hoxa7 基因缺陷小鼠表现为小耳 畸形、腭裂畸、开放眼裂畸形 [29]。Hoxa2 基因是第 二鳃弓内唯一表达的 Hox 基因，敲除小鼠 Hoxa2 基 因后，小鼠除了表现为无耳畸形，还出现了两个镜像 外耳道 [5，15]。关于人类中研究，Alasti 报道在一个常 染色体隐性遗传的综合征型小耳畸形家系中发现了 HOXA2 的错义突变 [16]，Brown 等在一个常染色体显 性遗传的非综合征型小耳畸形家系中发现了 HOXA2 的无义突变 [17]。 2.2.1.2 Six 基因与 Eya 基因。Six 基因是另外一种同 源异型盒基因。Six 基因通过调控第二鳃弓 NCC 的 前后体轴发挥作用 [34，35]。脊椎动物中 Six 结构域共 有 Sixl ～ 6 六个家族。其中 Six2 已确定为 Hoxa2、 Hox11 的下游基因。Hoxa2 缺失可以导致 Six2 的高 表达，Hox11 缺失则 Six2 表达降低 [36]。Eya 基因与 Six 基因通过形成 Eya-Six 转录复合体发挥其调控作 用。小鼠 Sixl / Six4 复合突变表现为小耳畸形。关 于人类的研究得到了类似的结论，EYA-SIX 作为一 个转录复合体发挥作用，SIX2 基因、SALL1 基因是 该转录复合体的下游基因 [37]。EYA1、SIX1、SIX5 基因的突变与 BO、BOR 综合征相关 [34]。 2.2.1.3 Tbx1 基因。T-box(Tbx)基因是指包含编 码 T-box 多肽保守结构域的一个基因家族。Tbxl 在 鳃弓中胚层和外胚层表达，引导来源于不同部位的 NCCs 细胞束的正确分离进入各鳃弓 [34]。Tbxl 突变 可以导致小鼠的外、中内耳发育畸形。关于人类的研 究中，DiGeorge 缺失综合征的患者表现为外耳畸形、 听力障碍，颅面部畸形，染色体分析发现患者在 22 号染色体末端有 3Mb 染色体片段的缺失，该片段内 筛选出的致病基因为 TBX1 基因 [30]。 2.2.1.4 Hmx1 基因。Hmx1 基因是一种在神经系统 中发现的同源框基因，调节鳃弓 NCCs 的定位以及周 围自主神经系统和感觉神经元的发育。小鼠 Hmx1 基 因编码区突变导致耳廓呈位置较低的招风耳畸形[39]。 而基因非编码元件的突变在大鼠、小鼠形成单纯性小 耳畸形 [40，41]。人类相关的研究中发现，HMX1 编码 序列的突变导致眼耳综合征 [42]。 2.2.1.5 TCOF1 基 因。TCOF1 基 因 能 够 翻 译 形 成 Treacle 蛋白，TCOF1 基因突变可以导致 Treacle 蛋白 合成障碍，导致核糖体合成减少 [43]。因此迁移至第 一第二鳃弓的 NCCs 增殖减少、凋亡增加，临床上形 成典型的 Treacher-Collins 综合征 [44]。 2.2.2 小耳畸形相关的信号通路。NCCs 迁移分化入 各鳃弓之后发育成颅面部各组织 [45]。基因和转录因 子通过一定的信号通路参与调节神经嵴细胞的发育， 如内皮素(Edn1)通路、Shh 通路、成纤维细胞生长 因子(FGF)通路、骨形态发生蛋白通路(BMP)、 维甲酸通路等。 2.2.2.1 内皮素信号通路。内皮素信号通路在调节 NCCs 分化形成下颌骨、面部组织的过程中扮演重要 万方数据专题论坛 耳廓美学 FEATURE 27 中国医学文摘耳鼻咽喉科学 Chinese Medical Digest：Otorhinolaryngology/ Jan. 2017, Vol.32, No.1 角色 [29]。表皮形成的内皮素与内皮素受体结合后， 激活核内相关基因的表达，形成 Edn1/Ednra → Dlx5/ Dlx6 → Hand2 形式。内皮素信号通路是保证下颌 突来源相关结构能够正常发育的分子基础 [46]。在小 鼠模型的研究中表明，选择性失活 Edn1 或其受体 (Ednra)可以导致第一腮弓下颌突来源的结构缺失， 被上颌突来源的结构代替 [47]。对眼耳综合征的病人 进行基因筛查，发现了内皮素通路相关的信号传感器 基因 PLCB4 突变导致畸形形成 [48]。 2.2.2.2 成纤维细胞生长因子(FGF)通路和骨形态 发生蛋白(BMP)通路。FGF、BMP 分子在外耳及 头颅形态发生过程中发挥多重作用 [29，49]。具体表现 在：① FGF 是 NCCs 关键成活因子，Fgf8 失活的小 鼠变现为 NCC 大量凋亡 [32]，斑马鱼中 fgf3 表达水 平下调会导致第三第四鳃弓 NCCs 凋亡 [50];② Fgf 通 过 诱 发 Dlx1 和 Barx1 的 表 达、Bmp 通 过 诱 发 Msx1 的表达来调控 NCCs 前后轴和远近轴模式 [51]; ③ Fgf8、Bmp 信号通路能够被 Shh 所诱发，与内皮 素通路密切相关。研究证明，小鼠 Fgf8、Fgf10 突变 形成较小的外耳耳廓 [52]，Fgfr 突变导致外耳体积较 小及外耳道畸形 [53]。另外，FGF 突变与 LADD 综合 征相关 [29]。 2.2.2.3 Shh 通路。Shh 基因是 Hox 基因的上游基 因。Shh 基因蛋白产物 Shh 与 NCCs 的存活、增殖和 定位有关。Shh 的缺失可以导致下颌突内的软骨原基 Mechel 软骨的缺失，从而导致相关结构如锤骨头、 砧骨体、外耳以及下颌骨的发育畸形 [54，55]。 2.2.2.4 维甲酸通路。内源性维甲酸在神经嵴形成， 神经嵴细胞的迁移分化以及鳃弓发育中发挥调节作 用。维甲酸合成酶的失活可以导致额鼻突来源结构 如鼻部、眼周的畸形，在鳃弓部位则表现为 NCC 来 源软骨的发育畸形 [15，56]。维甲酸的靶基因为 Hox 基 因，参与调节神经嵴细胞的前后轴模式，同时，维甲 酸与 FGF 信号通路及 BMP 信号通路相互作用，调节 NCC 的准确迁移及分化发育。 2.2.2.5 Wnt 信号通路。Wnt 基因与 NCCs 的分化 相关，Wnt 基因敲除的小鼠在胚胎早期死亡 [57]。 Wnt5a 敲除的小鼠表现为体积稍小的耳廓。另有报道 Goldenhar 综合征与 Wnt5b 相关 [57]，但目前没有 Wnt 基因突变导致小耳畸形的研究 [29]。 3 研究展望 小耳畸形的遗传学病因一直是学者关注的重 点。目前针对小耳畸形的遗传学病因，研究者做了 大量的研究，近年来遗传研究技术的不断发展给研 究者提供了较好的研究方法，在足够样本量以及获 得完整详细临床表型的前提下，全基因组关联分析 (GWAS)、外显子组测序、家系连锁分析以及基 因拷贝数变异均是研究小耳畸形致病基因的有效策 略。我们用 GWAS 研究方法，分别对 942 例小耳畸 形患者和 2012 例正常对照进行了 90 万个 SNP(单 核苷酸多态性)位点进行了检测，共检测出小耳畸 形显著相关的位点 8 个、可能相关位点 5 个 [6]。该 13 个位点包含非常多的 NCC 发育及血管形成相关 的基因，鉴于 NCC 对于外耳发育的重要程度，这些 基因极有可能是小耳畸形的致病基因。在我们研究 的基础上，可以通过多中心 Meta 分析验证上述相 关位点，也可以进一步发现新的相关位点;另外， 可以通过对更多样本进行相关位点高通量测序，明 确致病基因。

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　　8 中国医学文摘耳鼻咽喉科学 Chinese Medical Digest：Otorhinolaryngology/ Jan. 2017, Vol.32, No.1 (收稿日期：2016-12-23) 编辑 张天宇 胡丹 参考文献 genetics ofmicrotia-anotia;a registry based study on over one million births. J MedGenet，1995，32：453-457.

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